近日，江南大學食品科學與技術學院、食品科學與資源國家重點實驗室曾茂茂教授團隊課題組的研究成果“Genomic and Transcriptomic Analysis of Mutant Bacillus subtilis with Enhanced Nattokinase Production via ARTP Mutagenesis“在《Foods》期刊發表。
該研究通過ARTP誘變獲得突變株JNC002.001，納豆激酶（NK）活性達300.0±4.7 FU/mL，較初始菌株提升1.84倍，為目前報道的食品級安全菌株中最高水平。這項研究表明，ARTP誘變是修飾菌株特性的有效方法，Jnc002.001菌株有望用于NK的大規模生產和高附加值食品應用。
一、研究背景
納豆激酶（NK）是一種從納豆中提取的絲氨酸蛋白酶，具有強效溶栓、抗血小板聚集、降脂及抗動脈粥樣硬化功能，是心血管疾病預防的理想天然成分。隨著功能性食品和生物醫藥需求增長，NK全球市場規模持續擴大，但野生菌株產量低（通常<200 FU/mL）限制了工業化應用。
優良菌株篩選方面，傳統技術存在以下局限：
①自然篩選：效率低，難以突破產量閾值。
②基因工程：過表達aprN基因可提升產量，但存在質粒丟失、代謝負擔及法規限制（食品級安全風險）。
③傳統誘變（紫外線、化學誘變）：突變率低，篩選周期長，易引入有害突變。
本次研究采用ARTP誘變具有下列技術優勢：
①通過氦氣等離子體產生高活性粒子（如自由基、離子），直接破壞DNA鏈，誘導隨機突變，突變率是紫外線的10倍以上。
②屬于非轉基因，符合食品級安全要求；
③處理時間短（秒級），可通過調整功率和時間精準控制突變強度。
④廣譜適用，目前已成功用于細菌、真菌、酵母等多種微生物的高產菌株選育。
二、方法與技術平臺
1.菌株篩選與誘變（ARTP）
●初始菌株：從市售納豆中篩選出高產NK的野生型菌株SD2（初始活性124.4 FU/mL）。
●ARTP誘變：將種子培養物離心，并將沉淀重懸于無菌鹽水中以達到OD600值為0.6-0.8。將細胞懸液（10 μL）專用金屬載片上，使用ARTP-IIS進行誘變。SD2進行60秒ARTP處理（致死率90%）后，通過透明圈法和纖維蛋白活性測定篩選出突變株JNC002.001，其NK活性增加了71.5%，突出了ARTP誘變策略在增強枯草芽孢桿菌的NK生產能力方面具有顯著的有效性。
2.表型與遺傳穩定性驗證
●發酵特性：監測突變株的生長曲線、葡萄糖消耗、孢子形成效率及NK活性。
如下圖所示，盡管SD2和JNC002.001的OD600從0到8 h迅速增加，但JNC002.001的生長速率和葡萄糖消耗大于SD2。JNC002.001的NK活性始終高于SD2。JNC002.001在72小時的最大NK活性為300.0 ± 4.7 FU/mL，比SD2高1.8倍。發酵36 h后，JNC002.001的NK產量顯著高于SD2。
SD2和jnc002.001的孢子形成效率分別為38.13% 和0.33% ，表明jnc002.001在ARTP誘變后表現出孢子形成受損。這對于NK生產可能是有利的。JNC002.001中孢子形成受損可能將細胞資源從孢子轉移到了次級代謝產物的產生，從而增強了NK合成。此外，降低孢子形成率可以防止長時間代謝活性的喪失。
（圖 ：枯草芽孢桿菌 SD2 和 JNC002.001 在搖瓶中的發酵過程比較。（A）生長曲線和酶活性。（B）殘余葡萄糖。（C）SDS-PAGE分析。（D）孢子形成的百分比）
●遺傳穩定性：連續傳代30次后，NK活性保持穩定（300.0±4.7 FU/mL）。
3.多組學分析
SD2的基因組由一條長度為4,120,963 bp的圓形染色體組成，GC含量為43.47%。基因組包含4051個蛋白質編碼序列（CDS），87個tRNA基因和30個rRNA基因。
●基因組重測序：識別突變株的SNP和插入突變，定位關鍵基因（如kinA、gltA）
所有reads均與初始菌株SD2的參考基因組比對。在 7 個蛋白質編碼序列中產生8個SNP：包括5錯義突變（acoA、kinA、gltA、comC、yvyF）和3個同義突變（gltA、ganP、mdxK），基因間隔區：2個SNP和1 個插入（Ins），Ins位于mmgA基因的啟動子中。
●轉錄組分析：比較突變株與野生株的基因表達差異，重點關注NK合成、分泌及代謝通路。
轉錄組測序結果顯示，與初始菌株SD2相比，突變株JNC002.001中有2595個DEGs，其中1419個基因顯著下調，1176個基因顯著上調。
與中心碳代謝相關的關鍵基因調控圖譜及相關通路
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達的比較。隨著基因表達從下調到上調的變化，小方塊的顏色從綠色變為紅色。
轉錄分析中與信號轉導相關的aprN調控因子圖譜和相關途徑
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達的比較。隨著基因表達從下調到上調的變化，小方塊的顏色從綠色變為紅色。
三、主要結論
1.高產NK突變株的獲得
從納豆中分離出的野生型枯草芽孢桿菌SD2通過ARTP誘變成功獲得了高產NK的枯草芽孢桿菌JNC002.001菌株。菌株JNC002.001顯示出可靠的遺傳穩定性和顯著降低的孢子形成率。
突變株JNC002.001的NK活性較野生型提高1.84倍（300 FU/mL），發酵周期延長至72小時，NK產量持續積累。
2.分子機制解析
●基因組突變：發現10個SNP和1個插入突變，其中：kinA基因（孢子形成激酶A）突變導致孢子形成抑制，資源轉向NK合成。gltA基因（谷氨酸合成酶）突變增強α-酮戊二酸代謝，促進谷氨酸積累（NK合成關鍵前體）。
●轉錄組變化：aprN基因（編碼NK）表達上調9.4倍。中心碳代謝基因（如pfkA、citZ）顯著上調，能量和氨基酸前體供應增強。Sec分泌途徑（secA、prsA）和蛋白折疊相關基因上調，提升NK分泌效率。
四、研究亮點總結
1.技術方法創新
首次通過ARTP誘變獲得食品級安全的高產NK菌株，突破傳統誘變效率瓶頸。
結合基因組與轉錄組分析，系統性揭示NK高產的多層次調控機制。
2.工業應用價值
Jnc002.001菌株有望用于NK的大規模生產和高附加值食品應用。
孢子形成缺陷減少發酵后期細胞自溶，簡化下游純化工藝。
關于ARTP-ⅡS誘變育種儀
常壓室溫等離子體誘變育種儀(AtmosphericRoomTemperature Plasma, ARTP)是基于ARTP技術,開發的世界上首臺利用等離子體的手段對微生物、動植物進行誘變育種的專用儀器。
●微生物型ARTP突變率高,結構緊湊、誘變速度快,一次誘變操作(數分鐘以內)即可獲得大容量突變庫,極大地提高了菌種突變的強度和突變庫容量。
●全能型ARTP作空間更大,作用強度更高,并針對不同誘變對象如花粉、小顆粒種子、受精卵等的不同特點,進行了結構優化,使操作更簡便,應用范圍更廣,效果更佳,能夠滿足不同品種的選育需求。
關于天木生物
天木生物專注于生物育種領域的高端儀器裝備的開發與應用，致力于通過高效的突變技術和高通量篩選技術，改造提升產業傳統菌種開發模式，為生物制造產業提質增效，提升我國生物產業的核心競爭力。
致力于為行業“細胞和菌種開發與篩選效率低”、“相關裝備成本昂貴”、“產業化落地困難”等難題提供優秀的解決方案。
近日，江南大學食品科學與技術學院、食品科學與資源國家重點實驗室曾茂茂教授團隊課題組的研究成果“Genomic and Transcriptomic Analysis of Mutant Bacillus subtilis with Enhanced Nattokinase Production via ARTP Mutagenesis“在《Foods》期刊發表。
該研究通過ARTP誘變獲得突變株JNC002.001，納豆激酶（NK）活性達300.0±4.7 FU/mL，較初始菌株提升1.84倍，為目前報道的食品級安全菌株中最高水平。這項研究表明，ARTP誘變是修飾菌株特性的有效方法，Jnc002.001菌株有望用于NK的大規模生產和高附加值食品應用。
一、研究背景
納豆激酶（NK）是一種從納豆中提取的絲氨酸蛋白酶，具有強效溶栓、抗血小板聚集、降脂及抗動脈粥樣硬化功能，是心血管疾病預防的理想天然成分。隨著功能性食品和生物醫藥需求增長，NK全球市場規模持續擴大，但野生菌株產量低（通常<200 FU/mL）限制了工業化應用。
優良菌株篩選方面，傳統技術存在以下局限：
①自然篩選：效率低，難以突破產量閾值。
②基因工程：過表達aprN基因可提升產量，但存在質粒丟失、代謝負擔及法規限制（食品級安全風險）。
③傳統誘變（紫外線、化學誘變）：突變率低，篩選周期長，易引入有害突變。
本次研究采用ARTP誘變具有下列技術優勢：
①通過氦氣等離子體產生高活性粒子（如自由基、離子），直接破壞DNA鏈，誘導隨機突變，突變率是紫外線的10倍以上。
②屬于非轉基因，符合食品級安全要求；
③處理時間短（秒級），可通過調整功率和時間精準控制突變強度。
④廣譜適用，目前已成功用于細菌、真菌、酵母等多種微生物的高產菌株選育。
二、方法與技術平臺
1.菌株篩選與誘變（ARTP）
●初始菌株：從市售納豆中篩選出高產NK的野生型菌株SD2（初始活性124.4 FU/mL）。
●ARTP誘變：將種子培養物離心，并將沉淀重懸于無菌鹽水中以達到OD600值為0.6-0.8。將細胞懸液（10 μL）專用金屬載片上，使用ARTP-IIS進行誘變。SD2進行60秒ARTP處理（致死率90%）后，通過透明圈法和纖維蛋白活性測定篩選出突變株JNC002.001，其NK活性增加了71.5%，突出了ARTP誘變策略在增強枯草芽孢桿菌的NK生產能力方面具有顯著的有效性。
2.表型與遺傳穩定性驗證
●發酵特性：監測突變株的生長曲線、葡萄糖消耗、孢子形成效率及NK活性。
如下圖所示，盡管SD2和JNC002.001的OD600從0到8 h迅速增加，但JNC002.001的生長速率和葡萄糖消耗大于SD2。JNC002.001的NK活性始終高于SD2。JNC002.001在72小時的最大NK活性為300.0 ± 4.7 FU/mL，比SD2高1.8倍。發酵36 h后，JNC002.001的NK產量顯著高于SD2。
SD2和jnc002.001的孢子形成效率分別為38.13% 和0.33% ，表明jnc002.001在ARTP誘變后表現出孢子形成受損。這對于NK生產可能是有利的。JNC002.001中孢子形成受損可能將細胞資源從孢子轉移到了次級代謝產物的產生，從而增強了NK合成。此外，降低孢子形成率可以防止長時間代謝活性的喪失。
（圖 ：枯草芽孢桿菌 SD2 和 JNC002.001 在搖瓶中的發酵過程比較。（A）生長曲線和酶活性。（B）殘余葡萄糖。（C）SDS-PAGE分析。（D）孢子形成的百分比）
●遺傳穩定性：連續傳代30次后，NK活性保持穩定（300.0±4.7 FU/mL）。
3.多組學分析
SD2的基因組由一條長度為4,120,963 bp的圓形染色體組成，GC含量為43.47%。基因組包含4051個蛋白質編碼序列（CDS），87個tRNA基因和30個rRNA基因。
●基因組重測序：識別突變株的SNP和插入突變，定位關鍵基因（如kinA、gltA）
所有reads均與初始菌株SD2的參考基因組比對。在 7 個蛋白質編碼序列中產生8個SNP：包括5錯義突變（acoA、kinA、gltA、comC、yvyF）和3個同義突變（gltA、ganP、mdxK），基因間隔區：2個SNP和1 個插入（Ins），Ins位于mmgA基因的啟動子中。
●轉錄組分析：比較突變株與野生株的基因表達差異，重點關注NK合成、分泌及代謝通路。
轉錄組測序結果顯示，與初始菌株SD2相比，突變株JNC002.001中有2595個DEGs，其中1419個基因顯著下調，1176個基因顯著上調。
與中心碳代謝相關的關鍵基因調控圖譜及相關通路
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達的比較。隨著基因表達從下調到上調的變化，小方塊的顏色從綠色變為紅色。
轉錄分析中與信號轉導相關的aprN調控因子圖譜和相關途徑
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達的比較。隨著基因表達從下調到上調的變化，小方塊的顏色從綠色變為紅色。
三、主要結論
1.高產NK突變株的獲得
從納豆中分離出的野生型枯草芽孢桿菌SD2通過ARTP誘變成功獲得了高產NK的枯草芽孢桿菌JNC002.001菌株。菌株JNC002.001顯示出可靠的遺傳穩定性和顯著降低的孢子形成率。
突變株JNC002.001的NK活性較野生型提高1.84倍（300 FU/mL），發酵周期延長至72小時，NK產量持續積累。
2.分子機制解析
●基因組突變：發現10個SNP和1個插入突變，其中：kinA基因（孢子形成激酶A）突變導致孢子形成抑制，資源轉向NK合成。gltA基因（谷氨酸合成酶）突變增強α-酮戊二酸代謝，促進谷氨酸積累（NK合成關鍵前體）。
●轉錄組變化：aprN基因（編碼NK）表達上調9.4倍。中心碳代謝基因（如pfkA、citZ）顯著上調，能量和氨基酸前體供應增強。Sec分泌途徑（secA、prsA）和蛋白折疊相關基因上調，提升NK分泌效率。
四、研究亮點總結
1.技術方法創新
首次通過ARTP誘變獲得食品級安全的高產NK菌株，突破傳統誘變效率瓶頸。
結合基因組與轉錄組分析，系統性揭示NK高產的多層次調控機制。
2.工業應用價值
Jnc002.001菌株有望用于NK的大規模生產和高附加值食品應用。
孢子形成缺陷減少發酵后期細胞自溶，簡化下游純化工藝。
關于ARTP-ⅡS誘變育種儀
常壓室溫等離子體誘變育種儀(AtmosphericRoomTemperature Plasma, ARTP)是基于ARTP技術,開發的世界上首臺利用等離子體的手段對微生物、動植物進行誘變育種的專用儀器。
●微生物型ARTP突變率高,結構緊湊、誘變速度快,一次誘變操作(數分鐘以內)即可獲得大容量突變庫,極大地提高了菌種突變的強度和突變庫容量。
●全能型ARTP作空間更大,作用強度更高,并針對不同誘變對象如花粉、小顆粒種子、受精卵等的不同特點,進行了結構優化,使操作更簡便,應用范圍更廣,效果更佳,能夠滿足不同品種的選育需求。
關于天木生物
天木生物專注于生物育種領域的高端儀器裝備的開發與應用，致力于通過高效的突變技術和高通量篩選技術，改造提升產業傳統菌種開發模式，為生物制造產業提質增效，提升我國生物產業的核心競爭力。
致力于為行業“細胞和菌種開發與篩選效率低”、“相關裝備成本昂貴”、“產業化落地困難”等難題提供優秀的解決方案。
