近日，江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、食品科學(xué)與資源國家重點實驗室曾茂茂教授團隊課題組的研究成果“Genomic and Transcriptomic Analysis of Mutant Bacillus subtilis with Enhanced Nattokinase Production via ARTP Mutagenesis“在《Foods》期刊發(fā)表。
該研究通過ARTP誘變獲得突變株JNC002.001，納豆激酶（NK）活性達300.0±4.7 FU/mL，較初始菌株提升1.84倍，為目前報道的食品級安全菌株中最高水平。這項研究表明，ARTP誘變是修飾菌株特性的有效方法，Jnc002.001菌株有望用于NK的大規(guī)模生產(chǎn)和高附加值食品應(yīng)用。
一、研究背景
納豆激酶（NK）是一種從納豆中提取的絲氨酸蛋白酶，具有強效溶栓、抗血小板聚集、降脂及抗動脈粥樣硬化功能，是心血管疾病預(yù)防的理想天然成分。隨著功能性食品和生物醫(yī)藥需求增長，NK全球市場規(guī)模持續(xù)擴大，但野生菌株產(chǎn)量低（通常<200 FU/mL）限制了工業(yè)化應(yīng)用。
優(yōu)良菌株篩選方面，傳統(tǒng)技術(shù)存在以下局限：
①自然篩選：效率低，難以突破產(chǎn)量閾值。
②基因工程：過表達aprN基因可提升產(chǎn)量，但存在質(zhì)粒丟失、代謝負擔(dān)及法規(guī)限制（食品級安全風(fēng)險）。
③傳統(tǒng)誘變（紫外線、化學(xué)誘變）：突變率低，篩選周期長，易引入有害突變。
本次研究采用ARTP誘變具有下列技術(shù)優(yōu)勢：
①通過氦氣等離子體產(chǎn)生高活性粒子（如自由基、離子），直接破壞DNA鏈，誘導(dǎo)隨機突變，突變率是紫外線的10倍以上。
②屬于非轉(zhuǎn)基因，符合食品級安全要求；
③處理時間短（秒級），可通過調(diào)整功率和時間精準(zhǔn)控制突變強度。
④廣譜適用，目前已成功用于細菌、真菌、酵母等多種微生物的高產(chǎn)菌株選育。
二、方法與技術(shù)平臺
1.菌株篩選與誘變（ARTP）
●初始菌株：從市售納豆中篩選出高產(chǎn)NK的野生型菌株SD2（初始活性124.4 FU/mL）。
●ARTP誘變：將種子培養(yǎng)物離心，并將沉淀重懸于無菌鹽水中以達到OD600值為0.6-0.8。將細胞懸液（10 μL）專用金屬載片上，使用ARTP-IIS進行誘變。SD2進行60秒ARTP處理（致死率90%）后，通過透明圈法和纖維蛋白活性測定篩選出突變株JNC002.001，其NK活性增加了71.5%，突出了ARTP誘變策略在增強枯草芽孢桿菌的NK生產(chǎn)能力方面具有顯著的有效性。
2.表型與遺傳穩(wěn)定性驗證
●發(fā)酵特性：監(jiān)測突變株的生長曲線、葡萄糖消耗、孢子形成效率及NK活性。
如下圖所示，盡管SD2和JNC002.001的OD600從0到8 h迅速增加，但JNC002.001的生長速率和葡萄糖消耗大于SD2。JNC002.001的NK活性始終高于SD2。JNC002.001在72小時的最大NK活性為300.0 ± 4.7 FU/mL，比SD2高1.8倍。發(fā)酵36 h后，JNC002.001的NK產(chǎn)量顯著高于SD2。
SD2和jnc002.001的孢子形成效率分別為38.13% 和0.33% ，表明jnc002.001在ARTP誘變后表現(xiàn)出孢子形成受損。這對于NK生產(chǎn)可能是有利的。JNC002.001中孢子形成受損可能將細胞資源從孢子轉(zhuǎn)移到了次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而增強了NK合成。此外，降低孢子形成率可以防止長時間代謝活性的喪失。
（圖 ：枯草芽孢桿菌 SD2 和 JNC002.001 在搖瓶中的發(fā)酵過程比較。（A）生長曲線和酶活性。（B）殘余葡萄糖。（C）SDS-PAGE分析。（D）孢子形成的百分比）
●遺傳穩(wěn)定性：連續(xù)傳代30次后，NK活性保持穩(wěn)定（300.0±4.7 FU/mL）。
3.多組學(xué)分析
SD2的基因組由一條長度為4,120,963 bp的圓形染色體組成，GC含量為43.47%。基因組包含4051個蛋白質(zhì)編碼序列（CDS），87個tRNA基因和30個rRNA基因。
●基因組重測序：識別突變株的SNP和插入突變，定位關(guān)鍵基因（如kinA、gltA）
所有reads均與初始菌株SD2的參考基因組比對。在 7 個蛋白質(zhì)編碼序列中產(chǎn)生8個SNP：包括5錯義突變（acoA、kinA、gltA、comC、yvyF）和3個同義突變（gltA、ganP、mdxK），基因間隔區(qū)：2個SNP和1 個插入（Ins），Ins位于mmgA基因的啟動子中。
●轉(zhuǎn)錄組分析：比較突變株與野生株的基因表達差異，重點關(guān)注NK合成、分泌及代謝通路。
轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，與初始菌株SD2相比，突變株JNC002.001中有2595個DEGs，其中1419個基因顯著下調(diào)，1176個基因顯著上調(diào)。
與中心碳代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因調(diào)控圖譜及相關(guān)通路
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達的比較。隨著基因表達從下調(diào)到上調(diào)的變化，小方塊的顏色從綠色變?yōu)榧t色。
轉(zhuǎn)錄分析中與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的aprN調(diào)控因子圖譜和相關(guān)途徑
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達的比較。隨著基因表達從下調(diào)到上調(diào)的變化，小方塊的顏色從綠色變?yōu)榧t色。
三、主要結(jié)論
1.高產(chǎn)NK突變株的獲得
從納豆中分離出的野生型枯草芽孢桿菌SD2通過ARTP誘變成功獲得了高產(chǎn)NK的枯草芽孢桿菌JNC002.001菌株。菌株JNC002.001顯示出可靠的遺傳穩(wěn)定性和顯著降低的孢子形成率。
突變株JNC002.001的NK活性較野生型提高1.84倍（300 FU/mL），發(fā)酵周期延長至72小時，NK產(chǎn)量持續(xù)積累。
2.分子機制解析
●基因組突變：發(fā)現(xiàn)10個SNP和1個插入突變，其中：kinA基因（孢子形成激酶A）突變導(dǎo)致孢子形成抑制，資源轉(zhuǎn)向NK合成。gltA基因（谷氨酸合成酶）突變增強α-酮戊二酸代謝，促進谷氨酸積累（NK合成關(guān)鍵前體）。
●轉(zhuǎn)錄組變化：aprN基因（編碼NK）表達上調(diào)9.4倍。中心碳代謝基因（如pfkA、citZ）顯著上調(diào)，能量和氨基酸前體供應(yīng)增強。Sec分泌途徑（secA、prsA）和蛋白折疊相關(guān)基因上調(diào)，提升NK分泌效率。
四、研究亮點總結(jié)
1.技術(shù)方法創(chuàng)新
首次通過ARTP誘變獲得食品級安全的高產(chǎn)NK菌株，突破傳統(tǒng)誘變效率瓶頸。
結(jié)合基因組與轉(zhuǎn)錄組分析，系統(tǒng)性揭示NK高產(chǎn)的多層次調(diào)控機制。
2.工業(yè)應(yīng)用價值
Jnc002.001菌株有望用于NK的大規(guī)模生產(chǎn)和高附加值食品應(yīng)用。
孢子形成缺陷減少發(fā)酵后期細胞自溶，簡化下游純化工藝。
關(guān)于ARTP-ⅡS誘變育種儀
常壓室溫等離子體誘變育種儀(AtmosphericRoomTemperature Plasma, ARTP)是基于ARTP技術(shù),開發(fā)的世界上首臺利用等離子體的手段對微生物、動植物進行誘變育種的專用儀器。
●微生物型ARTP突變率高,結(jié)構(gòu)緊湊、誘變速度快,一次誘變操作(數(shù)分鐘以內(nèi))即可獲得大容量突變庫,極大地提高了菌種突變的強度和突變庫容量。
●全能型ARTP作空間更大,作用強度更高,并針對不同誘變對象如花粉、小顆粒種子、受精卵等的不同特點,進行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化,使操作更簡便,應(yīng)用范圍更廣,效果更佳,能夠滿足不同品種的選育需求。
關(guān)于天木生物
天木生物專注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開發(fā)與應(yīng)用，致力于通過高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國生物產(chǎn)業(yè)的核心競爭力。
致力于為行業(yè)“細胞和菌種開發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
近日，江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、食品科學(xué)與資源國家重點實驗室曾茂茂教授團隊課題組的研究成果“Genomic and Transcriptomic Analysis of Mutant Bacillus subtilis with Enhanced Nattokinase Production via ARTP Mutagenesis“在《Foods》期刊發(fā)表。
該研究通過ARTP誘變獲得突變株JNC002.001，納豆激酶（NK）活性達300.0±4.7 FU/mL，較初始菌株提升1.84倍，為目前報道的食品級安全菌株中最高水平。這項研究表明，ARTP誘變是修飾菌株特性的有效方法，Jnc002.001菌株有望用于NK的大規(guī)模生產(chǎn)和高附加值食品應(yīng)用。
一、研究背景
納豆激酶（NK）是一種從納豆中提取的絲氨酸蛋白酶，具有強效溶栓、抗血小板聚集、降脂及抗動脈粥樣硬化功能，是心血管疾病預(yù)防的理想天然成分。隨著功能性食品和生物醫(yī)藥需求增長，NK全球市場規(guī)模持續(xù)擴大，但野生菌株產(chǎn)量低（通常<200 FU/mL）限制了工業(yè)化應(yīng)用。
優(yōu)良菌株篩選方面，傳統(tǒng)技術(shù)存在以下局限：
①自然篩選：效率低，難以突破產(chǎn)量閾值。
②基因工程：過表達aprN基因可提升產(chǎn)量，但存在質(zhì)粒丟失、代謝負擔(dān)及法規(guī)限制（食品級安全風(fēng)險）。
③傳統(tǒng)誘變（紫外線、化學(xué)誘變）：突變率低，篩選周期長，易引入有害突變。
本次研究采用ARTP誘變具有下列技術(shù)優(yōu)勢：
①通過氦氣等離子體產(chǎn)生高活性粒子（如自由基、離子），直接破壞DNA鏈，誘導(dǎo)隨機突變，突變率是紫外線的10倍以上。
②屬于非轉(zhuǎn)基因，符合食品級安全要求；
③處理時間短（秒級），可通過調(diào)整功率和時間精準(zhǔn)控制突變強度。
④廣譜適用，目前已成功用于細菌、真菌、酵母等多種微生物的高產(chǎn)菌株選育。
二、方法與技術(shù)平臺
1.菌株篩選與誘變（ARTP）
●初始菌株：從市售納豆中篩選出高產(chǎn)NK的野生型菌株SD2（初始活性124.4 FU/mL）。
●ARTP誘變：將種子培養(yǎng)物離心，并將沉淀重懸于無菌鹽水中以達到OD600值為0.6-0.8。將細胞懸液（10 μL）專用金屬載片上，使用ARTP-IIS進行誘變。SD2進行60秒ARTP處理（致死率90%）后，通過透明圈法和纖維蛋白活性測定篩選出突變株JNC002.001，其NK活性增加了71.5%，突出了ARTP誘變策略在增強枯草芽孢桿菌的NK生產(chǎn)能力方面具有顯著的有效性。
2.表型與遺傳穩(wěn)定性驗證
●發(fā)酵特性：監(jiān)測突變株的生長曲線、葡萄糖消耗、孢子形成效率及NK活性。
如下圖所示，盡管SD2和JNC002.001的OD600從0到8 h迅速增加，但JNC002.001的生長速率和葡萄糖消耗大于SD2。JNC002.001的NK活性始終高于SD2。JNC002.001在72小時的最大NK活性為300.0 ± 4.7 FU/mL，比SD2高1.8倍。發(fā)酵36 h后，JNC002.001的NK產(chǎn)量顯著高于SD2。
SD2和jnc002.001的孢子形成效率分別為38.13% 和0.33% ，表明jnc002.001在ARTP誘變后表現(xiàn)出孢子形成受損。這對于NK生產(chǎn)可能是有利的。JNC002.001中孢子形成受損可能將細胞資源從孢子轉(zhuǎn)移到了次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而增強了NK合成。此外，降低孢子形成率可以防止長時間代謝活性的喪失。
（圖 ：枯草芽孢桿菌 SD2 和 JNC002.001 在搖瓶中的發(fā)酵過程比較。（A）生長曲線和酶活性。（B）殘余葡萄糖。（C）SDS-PAGE分析。（D）孢子形成的百分比）
●遺傳穩(wěn)定性：連續(xù)傳代30次后，NK活性保持穩(wěn)定（300.0±4.7 FU/mL）。
3.多組學(xué)分析
SD2的基因組由一條長度為4,120,963 bp的圓形染色體組成，GC含量為43.47%。基因組包含4051個蛋白質(zhì)編碼序列（CDS），87個tRNA基因和30個rRNA基因。
●基因組重測序：識別突變株的SNP和插入突變，定位關(guān)鍵基因（如kinA、gltA）
所有reads均與初始菌株SD2的參考基因組比對。在 7 個蛋白質(zhì)編碼序列中產(chǎn)生8個SNP：包括5錯義突變（acoA、kinA、gltA、comC、yvyF）和3個同義突變（gltA、ganP、mdxK），基因間隔區(qū)：2個SNP和1 個插入（Ins），Ins位于mmgA基因的啟動子中。
●轉(zhuǎn)錄組分析：比較突變株與野生株的基因表達差異，重點關(guān)注NK合成、分泌及代謝通路。
轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，與初始菌株SD2相比，突變株JNC002.001中有2595個DEGs，其中1419個基因顯著下調(diào)，1176個基因顯著上調(diào)。
與中心碳代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因調(diào)控圖譜及相關(guān)通路
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達的比較。隨著基因表達從下調(diào)到上調(diào)的變化，小方塊的顏色從綠色變?yōu)榧t色。
轉(zhuǎn)錄分析中與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的aprN調(diào)控因子圖譜和相關(guān)途徑
說明：基因名稱旁邊的小方塊是指枯草芽孢桿菌JNC002.001與枯草芽孢桿菌SD2基因表達的比較。隨著基因表達從下調(diào)到上調(diào)的變化，小方塊的顏色從綠色變?yōu)榧t色。
三、主要結(jié)論
1.高產(chǎn)NK突變株的獲得
從納豆中分離出的野生型枯草芽孢桿菌SD2通過ARTP誘變成功獲得了高產(chǎn)NK的枯草芽孢桿菌JNC002.001菌株。菌株JNC002.001顯示出可靠的遺傳穩(wěn)定性和顯著降低的孢子形成率。
突變株JNC002.001的NK活性較野生型提高1.84倍（300 FU/mL），發(fā)酵周期延長至72小時，NK產(chǎn)量持續(xù)積累。
2.分子機制解析
●基因組突變：發(fā)現(xiàn)10個SNP和1個插入突變，其中：kinA基因（孢子形成激酶A）突變導(dǎo)致孢子形成抑制，資源轉(zhuǎn)向NK合成。gltA基因（谷氨酸合成酶）突變增強α-酮戊二酸代謝，促進谷氨酸積累（NK合成關(guān)鍵前體）。
●轉(zhuǎn)錄組變化：aprN基因（編碼NK）表達上調(diào)9.4倍。中心碳代謝基因（如pfkA、citZ）顯著上調(diào)，能量和氨基酸前體供應(yīng)增強。Sec分泌途徑（secA、prsA）和蛋白折疊相關(guān)基因上調(diào)，提升NK分泌效率。
四、研究亮點總結(jié)
1.技術(shù)方法創(chuàng)新
首次通過ARTP誘變獲得食品級安全的高產(chǎn)NK菌株，突破傳統(tǒng)誘變效率瓶頸。
結(jié)合基因組與轉(zhuǎn)錄組分析，系統(tǒng)性揭示NK高產(chǎn)的多層次調(diào)控機制。
2.工業(yè)應(yīng)用價值
Jnc002.001菌株有望用于NK的大規(guī)模生產(chǎn)和高附加值食品應(yīng)用。
孢子形成缺陷減少發(fā)酵后期細胞自溶，簡化下游純化工藝。
關(guān)于ARTP-ⅡS誘變育種儀
常壓室溫等離子體誘變育種儀(AtmosphericRoomTemperature Plasma, ARTP)是基于ARTP技術(shù),開發(fā)的世界上首臺利用等離子體的手段對微生物、動植物進行誘變育種的專用儀器。
●微生物型ARTP突變率高,結(jié)構(gòu)緊湊、誘變速度快,一次誘變操作(數(shù)分鐘以內(nèi))即可獲得大容量突變庫,極大地提高了菌種突變的強度和突變庫容量。
●全能型ARTP作空間更大,作用強度更高,并針對不同誘變對象如花粉、小顆粒種子、受精卵等的不同特點,進行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化,使操作更簡便,應(yīng)用范圍更廣,效果更佳,能夠滿足不同品種的選育需求。
關(guān)于天木生物
天木生物專注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開發(fā)與應(yīng)用，致力于通過高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國生物產(chǎn)業(yè)的核心競爭力。
致力于為行業(yè)“細胞和菌種開發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
