本研究采用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變結(jié)合全自動(dòng)高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)(Microbial Microdroplet Culture system，MMC)篩選出耐4%(v/v)乳酸的突變株NCUF309.5-44。此研究首次將多組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于白酒釀造酵母的耐乳酸機(jī)制研究，并發(fā)現(xiàn)該菌株通過(guò)激活GSH/GPx抗氧化系統(tǒng)、強(qiáng)化細(xì)胞膜質(zhì)子泵功能及增強(qiáng)糖酵解代謝等協(xié)同機(jī)制提升耐受力。研究結(jié)果不僅為解析酵母耐乳酸機(jī)制提供新視角，還為工業(yè)菌株改良及固態(tài)白酒發(fā)酵工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

一、研究背景

1. 傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造工藝的特點(diǎn)與挑戰(zhàn)

傳統(tǒng)中國(guó)白酒的固態(tài)釀造過(guò)程，發(fā)酵和蒸餾在無(wú)大量游離液體的條件下進(jìn)行，酒醅作為發(fā)酵混合物，其環(huán)境因素在釀造過(guò)程中不斷動(dòng)態(tài)變化。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為酒醅發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物，易受到多種環(huán)境脅迫因素影響，如有機(jī)酸、乙醇、溫度波動(dòng)和滲透壓等。這些脅迫會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵速率降低、還原糖降解減少，最終影響發(fā)酵效率和白酒品質(zhì)。

2. 乳酸在固態(tài)白酒釀造中的關(guān)鍵作用與影響

在傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造過(guò)程中，乳酸是最主要的有機(jī)酸，其積累(濃度可達(dá)3.62%±0.62%)會(huì)顯著抑制釀酒酵母的生長(zhǎng)和代謝，導(dǎo)致發(fā)酵效率下降及最終產(chǎn)品品質(zhì)降低。針對(duì)高濃度乳酸脅迫下基因突變菌株的研究仍較為缺乏。

3. 酵母耐酸機(jī)制研究現(xiàn)狀

目前，關(guān)于酵母對(duì)酸脅迫潛在機(jī)制的研究文獻(xiàn)，主要集中在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和有機(jī)酸工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。例如，有研究表明酵母在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化過(guò)程中，可通過(guò)減緩某些氨基酸和核苷酸的合成、降低能量消耗，來(lái)增強(qiáng)對(duì)甲酸的耐受性并實(shí)現(xiàn)自我保護(hù) ;還有研究發(fā)現(xiàn)酵母能夠改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以增加硬度，從而提高對(duì)乙酸脅迫的耐受性。但針對(duì)釀酒酵母在白酒釀造環(huán)境下對(duì)乳酸的耐受機(jī)制研究仍較為缺乏。

二、菌株培養(yǎng)與特性分析

1. 菌株培養(yǎng)：

①菌株選擇與培養(yǎng)：

本研究選用了前期通過(guò)特定技術(shù)手段獲得的耐乳酸釀酒酵母菌株NCUF309.5-44，以及野生型菌株作為研究對(duì)象。其中，耐乳酸菌株的獲得，大氣壓室溫等離子體(ARTP)誘變與微生物微滴培養(yǎng)(MMC)技術(shù)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

②培養(yǎng)條件設(shè)置：

將兩種菌株分別接種于含有不同濃度乳酸的YPD培養(yǎng)基中，重點(diǎn)研究在4%(v/v)乳酸濃度下的生長(zhǎng)情況，該濃度模擬固態(tài)白酒釀造中后期酒醅中較高的乳酸含量。在設(shè)定的時(shí)間間隔(如0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h等)取樣，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)密度(如OD600值)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，以了解菌株在乳酸脅迫下的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。

③代謝性能測(cè)定：

通過(guò)對(duì)比耐乳酸菌株和野生型菌株在相同培養(yǎng)時(shí)間下的還原糖利用率和乙醇產(chǎn)量，評(píng)估乳酸脅迫對(duì)代謝性能的影響以及耐乳酸菌株在代謝方面的優(yōu)勢(shì)。

④抗氧化酶活性檢測(cè)：

在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，破碎后提取蛋白，采用相應(yīng)的生化檢測(cè)方法，測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)等抗氧化酶的活性。分析抗氧化酶活性在乳酸脅迫下的變化趨勢(shì)，探究菌株如何通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)乳酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

⑤基因組分析：

①測(cè)序與數(shù)據(jù)獲取：對(duì)耐乳酸菌株和野生型菌株進(jìn)行全基因組重測(cè)序;

②序列比對(duì)與變異檢測(cè)：將處理后的讀段與釀酒酵母的參考基因組進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)SNP和Indel的數(shù)量、分布位置，確定在編碼區(qū)、非編碼區(qū)以及基因間區(qū)的變異情況。

③變異基因功能注釋?zhuān)簩?duì)于檢測(cè)到的發(fā)生變異的基因，借助各類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋。

分析這些基因所參與的生物學(xué)過(guò)程、分子功能以及細(xì)胞組成相關(guān)信息，初步篩選出可能與乳酸耐受相關(guān)的基因。

⑥轉(zhuǎn)錄組分析：

①RNA提取與測(cè)序：分別提取在4 % (v/v)乳酸脅迫下耐乳酸菌株和野生型菌株不同時(shí)間點(diǎn)的總RNA，確保RNA的完整性和純度滿(mǎn)足測(cè)序要求。采用高通量RNA測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序，獲取基因轉(zhuǎn)錄本的序列信息和表達(dá)量數(shù)據(jù);

②數(shù)據(jù)處理與差異基因篩選：對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，將讀段比對(duì)到參考基因組上，計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，比較耐乳酸菌株和野生型菌株在乳酸脅迫下的基因表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)基因;

③差異基因功能富集分析：對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能富集分析，將基因歸類(lèi)到生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成三大類(lèi)功能注釋中，找出在乳酸脅迫下顯著富集的GO條目，明確菌株在細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)等方面的變化。同時(shí)進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，確定差異基因顯著富集的代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步揭示耐乳酸菌株應(yīng)對(duì)乳酸脅迫的分子機(jī)制。

2. 菌株特性分析

①基因組水平的適應(yīng)性進(jìn)化

研究發(fā)現(xiàn)，乳酸耐受菌株在基因組水平表現(xiàn)出顯著的適應(yīng)性突變。這些突變主要集中在與質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞膜完整性和應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)的功能基因上。通過(guò)比較基因組分析，鑒定出多個(gè)與乳酸耐受性顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和插入缺失變異(Indels)，這些遺傳變異共同構(gòu)成了菌株耐受性的基礎(chǔ)。

②轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)性重塑

在轉(zhuǎn)錄水平上，耐受菌株表現(xiàn)出全局性的基因表達(dá)重編程。核心調(diào)控因子的表達(dá)顯著上調(diào)，激活了下游約200個(gè)靶基因的表達(dá)。這些靶基因主要涉及：①細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng);②離子穩(wěn)態(tài)維持;③細(xì)胞壁生物合成。值得注意的是，糖酵解途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)普遍提高，而TCA循環(huán)相關(guān)基因則呈現(xiàn)差異化表達(dá)模式。

③氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)的強(qiáng)化

耐受菌株建立了多層次的抗氧化防御體系：①超氧化物歧化酶(SOD)活性提高;②過(guò)氧化氫酶(CAT)活性增加;③谷胱甘肽代謝相關(guān)酶活性顯著增強(qiáng)。這些變化使菌株的ROS清除能力提升3倍以上，有效緩解了乳酸脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。同時(shí)，硫氧還蛋白系統(tǒng)和DNA修復(fù)酶的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞的修復(fù)能力。

圖 1.原始菌株和乳酸耐受菌株之間 SNP 和 InDel 的 GO 注釋 （a） 和 KEGG 富集 （b） 結(jié)果。

圖 2.乳酸脅迫下原始菌株和耐乳酸菌株之間 DEGs 的 KEGG 富集分析結(jié)果 （（a）：上-DRGs;（b）：下 DEGs）

表 1   4%的乳酸對(duì)原始菌株和耐乳酸菌株抗氧化酶活性的影響。

四、研究亮點(diǎn)

1. 多組學(xué)整合揭示全局適應(yīng)機(jī)制

首次通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組的聯(lián)合分析，系統(tǒng)解析了釀酒酵母乳酸耐受的多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。鑒定出了58個(gè)關(guān)鍵基因突變和1235個(gè)差異表達(dá)基因。

2. 關(guān)鍵調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證

研究首次闡明了轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控乳酸耐受的新機(jī)制，鑒定出核心調(diào)控樞紐及其下游靶基因網(wǎng)絡(luò)?；谶@些發(fā)現(xiàn)成功開(kāi)發(fā)出具有顯著提升耐受性能的工程菌株，并建立了高效的分子標(biāo)記篩選體系，體現(xiàn)了基礎(chǔ)研究向應(yīng)用轉(zhuǎn)化的重要價(jià)值。

3. 防御系統(tǒng)的協(xié)同作用解析

研究深入揭示了抗氧化系統(tǒng)與細(xì)胞膜重塑在乳酸耐受中的協(xié)同保護(hù)作用，通過(guò)建立定量關(guān)系模型，為理解微生物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的系統(tǒng)性適應(yīng)策略提供了新見(jiàn)解，也為工業(yè)菌株的理性設(shè)計(jì)奠定了理論基礎(chǔ)。